Т.С. Попова, Н.С. Тропская, Т.В. Черненькая, Е.А. Кислякова, И.Г. Шашкова ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва, Россия
Контактная информация: Тамара Сергеевна Попова, д.м.н., профессор,заведующая научной лабораторией экспериментальной патологии НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва, Россия, e-mail: popova_nutr@mail.ru
Дата поступления статьи: 17.08.2016

В экспериментах на крысах изучена эффективность экстракта брожения кисломолочных бактерий Дайго с целью профилактики и коррекции нарушений состава микрофлоры и изменений моторной активности тонкой кишки при дисбиозе. Экспериментальный дисбиоз, вызванный 7-дневным пероральным приемом противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол), проявлялся существенными нарушениями в качественном и количественном составе микрофлоры тощей и слепой кишки. Профилактическое введение Дайго до введения противомикробных препаратов устраняло признаки дисбиоза.

Введение Дайго после моделирования дисбиоза приводило к восстановлению моторной функции кишечника, нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке и снижению содержания условно-патогенных микроорганизмов в слепой кишке.

Ключевые слова: экстракт брожения кисломолочных бактерий, микрофлора, моторная функция кишечника, экспериментальный дисбиоз.

Как известно, дисбактериоз кишечника – это синдром, сопутствующий многим патологическим состояниям и являющийся, в сущности, следствием патологического процесса. Среди многих причин возникновения дисбактериоза значимое место занимают нарушения микробиоценоза вследствие приема антибактериальных препаратов. Современные антибиотики являются основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы. Часто вследствие их бесконтрольного использования отмечается гибель не только патогенных микроор-ганизмов в естественных биотопах, но и представителей нормальной микрофлоры человека.

Концепция функционального питания, впервые сформулированная в Японии в конце 1990-х годов, получила широкое признание в решении проблемы коррекции состояния микроэкологической системы человека, являясь в наиболее развитых странах мира одним из приоритет-ных направлений в профилактике и лечении большинства хронических заболеваний.

Функциональное питание объединяет продукты естественного или искусственного происхождения, которые предназначены для систематического ежедневного употребления и оказывают регулирующее действие на физиологические функции, биохимические реакции и психосоциальное поведение человека через нормализацию его микроэкологического статуса.

В последнее время очень часто вопросы функционального питания обсуждаются в контексте развития проблемы использования про-, пре- и синбиотиков . Это связано прежде всего с тем, что концепция функционального питания становится более направленной на специальные продукты, которые могут положительно влиять на состав кишечной микрофлоры. Так, при первом успешном опыте трансплантации тонкой кишки в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского было продемонстрировано, что коррекция микрофлоры органов желудочно-кишечного тракта с помощью 2% раствора свекловичного пектина и пробиотиков привело к элиминации условно-патогенной флоры.

С апреля 2015 г. на российском рынке функциональных продуктов зарегистрирован и разрешен к применению японский продукт Дайго для поддержания микробиоценоза кишечника, усиления иммунитета, а также решения гастроэнтерологических проблем. В качестве активного ингре-диента Дайго содержит специально подобранный экстракт брожения 16 штаммов лактобактерий.

Дайго был разработан в качестве нового типа продуктов, производимых из кисломолочных бактерий, способствующих улучшению функционального состояния желудочно-кишечного тракта. В отличие от пробиотиков Дайго не содержит живых кисломолочных бактерий. Дайго представляет собой смесь пептидов – биорегуляторов, экстрагированных из бактериальных клеток 16 штаммов физиологических лактобактерий, колонизирующих кишечник здорового человека. Для получения соевого молока, используемого в качестве среды для культивирования кисло-молочных бактерий, применяются специальные соевые бобы, выращенные органическим путем без пестицидов и химикатов.

Экстракт кисломолочных бактерий является смесью секреторных продуктов и клеточных веществ кисломолоч-ных бактерий, полученных при их брожении. Исследования последних лет показали, что клеточные вещества и продукты брожения метаболизированных кисломолочных бактерий оказывают лучшее действие на кишечную регуляцию и жизненные функции, чем жизнеспособные кис-ломолочные бактерии.

Цель исследования – изучение эффективности функционального продукта Дайго в профилактике и коррекции состава микрофлоры и моторных нарушений тонкой кишки при экспериментальном дисбиозе у крыс.

Исследования были проведены на 28 взрослых крысах самцах (масса тела – около 300 г, возраст – 4 месяца) линии Вистар.

Крысы были получены из питомника ООО «НеоМаркет». Все экспериментальные животные содержа-лись в стандартных условиях вивария НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, получали воду и сбалансированный рацион питания (гранули-рованный корм, изготовленный по заказу ООО «Лабораторкорм») без ограничения. Световой режим – естественный.

Дизайн исследования

Все животные были разделены на 4 экспери-ментальные группы по 7 животных в каждой:

1. Контрольная группа – интактные животные (n = 7). У этих крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микро-биологического исследования.

2. Группа «Дисбиоз» – группа с эксперимен-тальным дисбиозом (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 7 суток перорально вводили раствор противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол). На 8-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.

3. Группа «Дисбиоз+Дайго» – группа с экспериментальным дисбиозом и корригирующим введением тестируемого раствора Дайго (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 7 суток перорально вводили раствор противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол), а с 8- го по 21-й день – тестируемый раствор Дайго. На 22-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.

4. Группа «Дайго+Дисбиоз» – группа с профилактическим введением тестируемого раствора Дайго и последующим введением противоми-кробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 14 суток перорально вводили тестируе-мый раствор Дайго, затем с 15-го по 21-й день – раствор противомикробных препаратов. На 22-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.

Дозы, схема и способ введения препаратов

Раствор Дайго вводили в количестве 0,33 мл/кг, амоксициклин – в дозе 28,5 мг/кг, метронидазол – в дозе 22,8 мг/кг.
Перед введением каждое животное взвешивали и производили расчет дозы препарата с учетом индивидуальной массы тела крысы.
Противомикробные препараты и исследуемый продукт Дайго вводили перорально, ежедневно с 9 до 11 часов утра.

Измерение эвакуаторной активности тонкой кишки

Измерение эвакуаторной активности тонкой кишки у экспериментальных животных производили с помощью инертного маркера Evans Blue. Для измерения эвакуаторной активности кишеч-ника крысам per os вводили маркер Evans Blue. Через 20 минут крыс усыпляли. На вскрытии выделяли тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) и измеряли длину всей кишки и расстояние, которое прошел маркер за 20 минут. Индекс транзита – ИТ, выраженный в процентах, определяли как отношение расстояния, пройденного мар-кером, к общей длине кишки, умноженное на 100.

Сбор проб для бактериологического исследования

Для забора проб выделяли участок тощей кишки на расстоянии 15 см от связки Трейтца длиной 5 см. В стерильную пробирку специальной лопаточкой брали кишечное содержимое (для исследования полостной микрофлоры тощей кишки). Затем выделенный участок промывали стерильным физиологическим раствором, производили соскоб пристеночного слоя (для исследования пристеночной микрофлоры тощей кишки) и помещали пробу в стерильную пробирку. Далее выделяли слепую кишку. В стерильную пробирку специальной лопаточкой брали кишечное содер-жимое (для исследования полостной микрофлоры слепой кишки).

Бактериологические исследования Микробиологическое исследование кала и содержимого тощей и слепой кишки проводили в соответствии с нормативными документами, принятыми для исследования кала у людей: отраслевым стандартом 91500.11.0004-2003 "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника". Были изучены 9 групп микроор-ганизмов: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli (E.coli), Proteus mirabilis, Klebsiella spp., неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ), Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp.
Данные представляли в виде медианы и персентилей – Ме (25; 75)%. Для статистического анализа использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считались значения при p<0,05.

Через 7 дней приема противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) у животных в группе «Дисбиоз» было выявлено статистически значимое замедление транзита содержимого по кишечнику по сравнению с контрольной группой – с 30,34 (19,56; 44,55)% до 25,17 (23,41; 31,84)% (p < 0,05).

При изучении изменений моторной функции тонкой кишки у животных группы «Дисбиоз+Дайго» отмечена тенденция к восстановлению транзита по кишечнику до 32,17 (24,05; 37,76)% по сравнению с группой «Дисбиоз» – 25,17 (23,41; 31,84)% (p > 0,05). При сравнении изменений эвакуаторной функции тонкой кишки у животных группы «Дисбиоз+Дайго» с контрольной группой статистически значимых различий не выявлено. Так, в группе «Дисбиоз+Дайго» ИТ составлял 32,17 (24,05; 37,76)%, а в контрольной – 30,34 (19,56; 44,55)% (p > 0,05), что свидетельствовало о нормализации транзита кишечного содержимого после приема Дайго.

При сравнении изменений моторной функции тонкой кишки у животных группы «Дайго+Дисбиоз» по отношению к группе «Дисбиоз» выявлена тенденция к восстановлению транзита содержимого по кишечнику. Так, в группе «Дайго+Дисбиоз» ИТ составлял 30,16 (28,36; 36,15)%, а в группе «Дисбиоз» – 25,17 (23,41; 31,84)% (p > 0,05). При сравнении изменений эвакуаторной функции тонкой кишки у животных группы «Дайго+Дисбиоз» с контрольной группой статистически значимых различий не выявлено.

Так, в группе «Дайго+Дисбиоз» ИТ составлял 30,16 (28,36; 36,15)%, а в контроль-ной – 30,34 (19,56; 44,55)% (p > 0,05), что свидетельствовало о нормализации транзита кишечного содержимого при приеме Дайго.

Таким образом, при моделировании экспериментального дисбиоза происходит нарушение моторной функции тонкой кишки, выражающееся в замедлении скорости транзита содержимого по кишечнику. Введение Дайго с целью как коррекции, так и профилактики дисбиоза приводит к нормализации моторной функции тонкой кишки.

Результаты изучения влияния 7-дневного приема противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) на состав микрофлоры тощей и слепой кишки представлены в табл. 1.

Данные таблицы показывают, что при экспериментальном дисбиозе развиваются существенные нарушения в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Так, в полости тощей кишки у некоторых животных обнаружили появление Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. При этом в пристеночном слое тощей кишки высеивались Enterococcus spр., Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке выявили наличие Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae.

Отметим, что в контрольной группе эти микроорганизмы не были обнаружены ни у одного животного.
В полости тощей кишки статистически значимо увеличивалось количество Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр., в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо повы-шалась численность Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Lactobacillus spр. В слепой кишке изменения в количественном отношении микроорганизмов по отношению к контролю были статистически значимы для всех изученных видов за исключением Kl.pneumoniae. Так, выявлено увеличение в 100 раз численности Enterococcus spр. и E.coli, а количество Staphylococcus spр., Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. было снижено.

Таким образом, по нашим данным, 7-дневный прием противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) приводит к существенным нарушениям в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Такие изменения, проявляющиеся в повышении количества E.coli в тонкой и слепой кишке, в перераспределении лакто- и бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника (уменьшение их количества в слепой и увеличение в тонкой), а также в появлении условно-патогенных видов микроорганизмов, не характерных для здоровых животных в тонкой и слепой кишке, могут свидетельствовать о возникновении дисбактериоза 3-й степени (по классификации В.М. Бондаренко).

При изучении изменений микрофлоры тощей и слепой кишки при корригирующем введении Дайго после моделирования экспериментально-го дисбиоза (группа «Дисбиоз+Дайго») получены следующие результаты (табл. 2).
Как видно из таблицы, у животных, которым вводили Дайго на фоне экспериментального дисбиоза, наблюдаются существенные изменения в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке по сравнению с животными с дисбиозом. Так, в полости тощей кишки у всех животных исчезли Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae, в пристеночном слое тощей кишки исчезли Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке исчезли Proteus mirabilis и Kl.pneumoniae.

В полости тощей кишки статистически значимо уменьшилось количество Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, а в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо понизилась численность Bifidobacterium spр. В слепой кишке статистически значимо увеличилось количество Staphylococcus spр.

Таким образом, наиболее значимым эффектом корригирующего влияния Дайго на фоне экспериментального дисбиоза по сравнению с животными с дисбиозом являются исчезновение условно-патогенной микрофлоры в пристеночном слое тонкой кишки и значительное снижение ее содержания в полости тонкой кишки.

Приводит ли корригирующее введение Дайго на фоне экспериментального дисбиоза к нормализации микрофлоры?

С этой целью было выполнено сравнение данных бактериологических исследований группы животных «Дисбиоз+Дайго» с контрольной группой (табл. 3).
Как видно из таблицы, у животных, которым вводили Дайго на фоне экспериментального дисбиоза, отсутствуют статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой в количественном составе условно-патогенной полостной и пристеночной микрофлоры тощей кишки, что свидетельствует о нормализации численности этих видов микроорганизмов при введении Дайго на фоне экспериментального дисбиоза. Кроме того, на фоне введения Дайго в полости тощей кишки было отмечено увеличение численности Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. (в 100 раз) по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных, а в пристеночном слое тощей кишки в 10 раз повысилось количество Lactobacillus spр. В слепой кишке по сравнению с контрольной группой статистически значимо уменьшилась численность Staphylococcus spр. (в 10 раз), Lactobacillus spр. (в 10 раз) и Bifidobacterium spр. (в 100 раз).
Таким образом, корригирующее введение Дайго после моделирования экспериментального дисбиоза приводит к нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке. В слепой кишке происходит снижение содержания как условно-патогенных микроорганизмов, так и лакто- и бифидобактерий по сравнению со здоровыми животными, что может свидетельствовать об эффективной коррекции экспериментального дисбиоза.

Интересно отметить, что корригирующий прием Дайго на фоне экспериментального дисбиоза приводит к увеличению количества Lactobacillus spр. как в полости, так и в пристеночном слое тонкой кишки. Кроме того, происходит перераспределение бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника – наблюдается увеличение их количества в полости тонкой кишки и снижение в слепой.
При изучении изменений микрофлоры тощей и слепой кишки на фоне профилактического введения Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза (группа «Дайго+Дисбиоз») получены следующие результаты (табл. 4).

Данные таблицы свидетельствуют о том, что у животных с профилактическим введением Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза наблюдались существенные изменения в каче-ственном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке по сравнению с животными с дисбиозом. Так, в полости тощей кишки у всех животных исчезли Kl.pneumoniae, в пристеночном слое тощей кишки исчезли Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке исчезли Kl.pneumoniae.
Кроме того, в полости тощей кишки статистически значимо уменьшилось количество Proteus mirabilis (в 1000 раз), в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо понизилась чис-ленность E.coli (в 10 000 раз). В слепой кишке статистически значимо увеличилось количество E.coli (в 10 раз).

Таким образом, наиболее значимым эффектом профилактического влияния Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза по сравнению с животными с дисбиозом является исчезновение и (или) значительное снижение условно-патогенной микрофлоры в полости и пристеночном слое тонкой кишки.

Приводит ли профилактическое введение Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза к нормализации микрофлоры?

С этой целью было выполнено сравнение данных бактериологических исследований группы животных «Дайго+Дисбиоз» с контрольной группой (табл. 5). Согласно данным, приведенным в таблице, у животных с профилактическим введением Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза отсутствуют статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой в количественном составе условно-патогенной пристеночной микрофлоры тощей кишки, что свидетельствует о нормализации численности этих видов микроорганизмов при профилакти-ческом приеме Дайго.

Кроме того, в пристеночном слое тощей кишки произошло увеличение численности Lactobacillus spр. (в 10 раз) по сравнению с ее значениями у интактных животных. Количественный состав условно-патогенной полостной микрофлоры тощей кишки также статистически значимо не отличался от такового в контрольной группе, за исключением E.coli, коли-чество которой возросло в 100 раз по сравнению с контролем. Кроме того, в полости тощей кишки произошло увеличение содержания Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. (в 100 раз) по сравнению с интактными животными. 

В слепой кишке наблюдались появление Proteus mirabilis и Enterobacter spр., рост числа Enterococcus spр. и E.coli, снижение количества Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр.

Таким образом, профилактическое введение Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза приводит к исчезновению условно-патогенных микроорганизмов в пристеночном слое тощей кишки и нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в полости тощей кишки (за исключением E.coli). Как и в серии с корригирующим приемом Дайго, его профилактическое введение при моделировании экспериментального дисбиоза приводит к увеличению количества Lactobacillus spр. в тонкой кишке как в полости, так и в пристеночном слое.

Кроме того, происходит перераспределение содержания бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника – наблюдаются увеличение их количества в полости тонкой кишки и сниже-ние в слепой.

В данном исследовании экспериментальный дисбиоз, ассоциированный с использованием противомикробных препаратов, у крыс был вызван пероральным введением двух противомикробных препаратов широкого спектра действия – амоксициклина и метронидазола – на протяжении 7 суток.

Было показано, что 7-дневный прием противомикробных препаратов приводит к существенным нарушениям в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Такие изменения, проявляю щиеся в повышении количества E.coli в тонкой и слепой кишке, в перераспределении лакто- и бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника (уменьшение их количества в слепой и увеличение в тонкой), а также в появлении условно-патогенных видов микроорганизмов, не характерных для здоровых животных в тонкой и слепой кишке, могут свидетельство-вать о возникновении тяжелого дисбактериоза 3-й степени (по классификации В.М. Бондаренко).

Глубокие дисбиотические изменения в кишечни-ке у крыс сопровождались нарушением моторной функции кишечника, выражающиеся в замедле-нии транзита кишечного содержимого.

Корригирующее введение Дайго после развития экспериментального дисбиоза приводило к нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке. В слепой кишке происходило снижение содержания условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с таковым у здоровых животных, что может свидетельствовать об эффективной коррекции экспериментального дисбиоза.

Эти изменения микрофлоры сопровождались восстановлением моторной функции кишечника.
Профилактическое введение Дайго до модели-рования экспериментального дисбиоза приводило к исчезновению условно-патогенных микроорганизмов в пристеночном слое тощей кишки и нормализации их численности в полости тощей кишки (за исключением E.coli). Эти изменения микрофлоры сопровождались нормализацией моторной функции кишечника.

Таким образом, проведенные исследования на крысах показали значительную эффективность экстракта брожения кисломолочных бактерий Дайго как для профилактики, так и коррекции нарушений моторной активности тонкой кишки и микробиоценоза кишечника при экспериментальном дисбиозе.