Данная статья опубликована в следующем журнале «Дав Пресс»:

Питание и биологически активные пищевые добавки

Эффект, оказываемый экстрактом брожения лактобактерий
(LEX от англ. Lactic Acid Bacteria-Fermented Soy Milk Extract), на 3-индоксил сульфат в моче здоровых женщин из Японии: открытое пилотное исследование


Мина Фукути, Таканори Ясутаке, Михо Матсумото, Рёхэй Мидзуно, Коичиро Фуджита, Ясухиро Сасуга
Научно-исследовательский центр в Хатиодзи, Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд., Хатиодзи-си, Токио, Япония;
Хэлскер Системз Ко., Лтд., Нагоя-си, Айти, Япония; Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд., Токио, Япония;
Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, Япония
Цель: Микробиота кишечника и её среда, включая метаболиты, не только играют важнейшую роль в профилактике заболеваний всего населения, но и сказывается на общем уровне качества его жизни. Оптимальный метод для мониторинга состояния среды кишечника – измерение уровня 3-индоксилсульфата в моче (3-ИС, англ. 3-IS). Подобный подход используется в течение нескольких лет. Целью настоящего исследования является определение эффективности биологически активной добавки «Дайго» (БАД), содержащей экстракт, ферментированный 16-тью штаммами молочнокислых бактерий (LEX), и состоящей не из живых бактерий, а из полезных продуктов секреции 16-ти штаммов молочнокислых бактерий и их микроструктурных компонентов) у здоровых женщин с высоким уровнем 3-ИС в моче.

Материалы и методы: В исследовании принимали участие японские женщины в возрасте от 30 до 50 лет; у участниц исследования наблюдался высокий уровень 3-ИС в моче и частые запоры. В течение 4 недель каждая из участниц ежедневно принимала 10 мл БАД с добавлением LEX. Первичной конечной точкой исследования было изменение уровня 3-ИС в моче, вторичной – частота дефекации и ряд прочих субъективных симптомов, характеризующих их физическое состояние (напр., шкала оценки запора/англ. Constipation Assessment Scale (CAS)).

Результаты: Общее количество участниц – 30 человек, конечное число участниц осталось неизменным. В результате приёма экспериментального препарата в течение 4 недель у каждой из участниц отмечалось статистически значимое снижение уровня 3-ИС в моче. Кроме того, любые изменения концентрации 3-ИС в моче демонстрировали тесную корреляцию с первоначальными уровнями 3-ИС. Помимо прочего, приём БАД с добавлением LEX положительно сказался на баллах, присваиваемых по CAS, и прочих субъективных симптомах. Уровень 3-ИС в моче демонстрировал умеренную степень корреляции с показателями общего физического состояния, в том числе с CAS (коэффициент корреляции Пирсона r = 0,21; p < 0,05).

Вывод: Полученные результаты позволяют предположить, что пероральный приём LEX положительно сказывается на уровне 3-ИС в моче как показателе здоровья кишечной среды и что мониторинг концентрации 3-ИС в моче является эффективной методикой оценки кишечной среды и общего физического состояния.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, 3-индоксилсульфат, кишечная среда, микробиота кишечника, постбиотики

Введение
Кишечник не только отвечает за пищеварительную функцию и всасывание питательных веществ, но и способствует поддержанию общего иммунитета, регуляции ЦНС и процесса детоксикации. Появляется всё больше подтверждений тому, что на функции кишечника влияет его среда, которая, в свою очередь, определяется такими факторами, как питание и наличие комменсальных бактерий (микробиоты). Кроме того, здоровье кишечной среды связано с развитием ряда заболеваний, например, аллергий и воспалений. Использование методов секвенирования нового поколения позволило значительно расширить наши познания о составе микробиоты и её взаимосвязи с заболеваниями.1 С недавнего времени ведутся активные обсуждения того, что же входит в состав здоровой микробиоты кишечника. Факты, установленные на настоящий момент, подтверждают правильность идеи о том, что кишечные микробиомы здоровых людей заселены аналогичными организмами, в основном, фирмикутами (лат. Firmicutes) и бактероидами (лат. Bacteroides).2 С другой стороны, в рамках некоторых исследований установлена широкая вариативность состава кишечной микробиоты среди здорового населения. Таким образом, выяснилось, что состав микробиома у каждого человека свой. 3

Основным фактором, определяющим популяцию человеческой микробиоты, является питание, поскольку употребляемая пища становится питательной средой для метаболизма микроорганизмов, что, в свою очередь, формирует состав и определяет функционирование микробиома.4 Состав микробиоты взаимосвязан с иммунитетом, поскольку микрофлора влияет на уровень отдельных метаболитов и сигнальные пути. Например, от состава микробиоты кишечника зависит такой метаболит, как триметиламин N-оксид (ТМАО), который, по данным исследований, вызывает атеросклероз и тромбоз.5 На примере ТМАО чётко видно, что микробиота и её метаболиты являются существенными сопутствующими факторами физиологии организма хозяина и патологической физиологии. 6-8

Изменения внутрикишечной среды, в том числе изменения уровня её метаболитов, играют важнейшую роль в профилактике заболеваний всего населения, а также сказываются на общем уровне качества его жизни. Плохое состояние кожи, запоры, диарея и плохое общее самочувствие могут быть связаны с составом кишечной среды. Использовать дорогостоящие методы анализа, например, секвенирование нового поколения и анализ метаболома (метаболом – это молекулярное «зеркало» жизни; -0432йц представляет собой совокупность всех метаболитов, являющихся конечным продуктом обмена веществ в клетке, ткани, органе или организме) , для изучения таких изменений физического состояния в обычной жизни не представляется возможным. Требуется простой и бюджетный вариант наблюдения за изменениями кишечной среды и бактериальных колоний.

Исследование, проведённое много лет назад, установило, что ряд метаболитов в моче (например, производные индола, фенолы и амины как производные от аминокислот) могут дать представление о состоянии внутрикишечной среды. 3-индоксилсульфат (3-ИС) – метаболит L-триптофана, содержащегося в продуктах питания (Trp); кроме того, 3-ИС – кардиотоксин и уремический токсин. Микробиота кишечника заставляет Trp распадаться на индол, который впоследствии всасывается кишечником, а затем преобразуется в 3-ИС печенью.9 Уровень 3-ИС в моче использовался для скрининга нарушений кишечной микрофлоры, чрезмерного развития микрофлоры тонкого кишечника, запоров, нарушений всасывания и проницаемости оболочки слизистой кишечника. 9-13.
Таким образом, уровень 3-ИС, измеряемый простым и финансово доступным путём (колориметрический анализ мочи), можно использовать для упрощённого наблюдения за состоянием кишечной среды.

Польза продуктов, созданных с помощью молочнокислых бактерий (LAB), для здоровья человека признаётся во всём мире. Известно, что ферментация с использованием бактерий LAB способствует перевариванию пищи и увеличивает биологическую ценность питательных веществ, содержащихся в ней. Выведены разновидности LAB (как пробиотики) и разработаны продукты питания, ферментированные с использованием молочнокислых бактерий, которые на сегодняшний день приносят пользу как человеку, так и животным, в частности, употребление их в пищу повышает пищевую ценность продуктов, усиливает способность противостоять инфекциям, облегчает симптомы непереносимости лактозы, изменяет интенсивность специфических/неспецифических иммунных ответов, контролирует уровень сывороточного холестерина и снижает риск развития заболеваний толстой кишки.14,15 В течение долгого времени соя используется для ферментации, в частности, на территории Восточной Азии; из неё готовят, к примеру, соевый соус, мисо, натто и темпе. Ряд исследований, посвящённых ферментации сои (и соевого молока) с использованием LAB, заявляет о физиологической функции этих продуктов. Тем не менее, в большинстве таких научных работ внимание учёных сконцентрировано на эффекте сои, ферментированной LAB, оказываемом на печень, например, липидный обмен (к примеру, метаболизм холестерина и триглицеридов), поскольку известно, что соя улучшает метаболизм липидов.16-21

Согласно другому исследованию, приём пищевых добавок, произведённых из экстракта, ферментированного несколькими штаммами молочнокислых бактерий (LEX) на основе соевого молока, может предотвратить развитие рака кишечника и активировать его клеточный иммунитет.22-23

В ходе предварительных исследований выявлено, что LEX уменьшает полипы человеческого кишечника, положительно влияет на его микрофлору и лечит заболевания пародонта.24-26

Положительный эффект заключается в том, что добавка LEX улучшает состояние внутрикишечной среды и состав микробиоты (требуется проверка). Метабиотики, открытые вслед за пробиотиками и пребиотиками, – относительно новый термин в мире биотиков. Это функциональные и биоактивные компоненты, образующиеся в матриксе в процессе ферментации, способные улучшать состояние здоровья человека.27,28 LEX также считается метабиотиком, использующим в качестве субстрата сою. Вероятно, исследования LEX позволят получить больше знаний о метабиотиках.

В представленном пилотном исследовании для оценки состояния кишечной среды и эффектов, оказываемых LEX на среду и метаболизм микробиоты, у испытуемых замерялся уровень 3-ИС в моче. В исследовании принимали участие здоровые женщины с высокой концентрацией 3-ИС в моче; замер уровня индоксил сульфата осуществлялся до и после приёма LEX. Кроме того, в исследовании учитывались симптомы, наблюдаемые у испытуемых в абдоминальной области, а также прочие ежедневные изменения физического состояния.
Материалы и методы
План исследования и участники
В рамках данного открытого пилотного исследования оценивались эффекты, оказываемые LEX на уровень 3-ИС в моче. Вторичные конечные точки исследования – изменения субъективных симптомов, связанных с дефекацией и общим физическим состоянием.

В исследовании приняли участие японские женщины в возрасте от 30 до 50 лет с жалобами на частые запоры. Был проведён скрининг 60 кандидатов, подавших заявку на участие в исследовании, из которых к участию были допущены 30 человек с повышенной концентрацией 3-ИС в моче. Из числа участников были исключены те, кто страдает от хронических заболеваний или имеет аллергию на сою, сырьё для изготовления тестируемого вещества.

Каждый из испытуемых дал информированное согласие, а Этический комитет систем здравоохранения (Ethics Committee of Healthcare Systems Co., Ltd., регистрационный номер 2001, Токио, Япония) одобрил проведение исследования. Исследование проведено в соответствии с положениями Хельсинской Декларации и зарегистрировано в Сети медицинской информации университетской клиники (ID UMIN000039276).
Daigo
Исследуемый препарат
Исследуемый препарат – представленная на рынке биологически активная добавка, изготовленная с использованием LAB (зарегистрированное в РФ название – DaigoTM); в состав данного препарата входит экстракт, ферментированный несколькими штаммами молочнокислых бактерий (LEX) на основе соевого молока, поставщик – компания «Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд.» (Токио, Япония). Для ферментации соевого молока использовалось 16 штаммов LAB (Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei и Lactobacillus plantarum), и в конечном продукте использовался экстракт ферментированного материала.
Daigo
Ход исследования
Участниц исследования отбирали через специальный сайт, по результатам заполнения предварительных анкет удалось отобрать 60 человек, страдающих от запоров и подходящих для участия в тестировании. 30 женщин от общего количества допущены к участию по показателю 3-ИС в моче. Испытуемые получили исследуемый препарат, дневник для записей, анкеты и набор для сбора мочи; каждому из них были даны указания принимать препарат раз в день в течение 4 недель.

Первичная конечная точка исследования – измерение уровней 3-ИС в моче. Показатели 3-индоксил сульфата фиксировались трижды: до начала эксперимента, через 2 и 4 недели после начала приёма тестируемого препарата; для замеров использовали набор реагентов для количественного анализа уровня индикана («БиоАссэй Системз», Калифорния, США). Это усовершенствованная версия метода Курзона и Уолша с использованием колориметрического анализа и замером концентрации креатинина (Cr), для анализа используется утренняя моча. Для количественной оценки уровня Cr в моче применяли автоматический анализатор (Accute RX, «Канто Медикал Системз», Тотиги, Япония) и набор реагентов для замера уровня Cr (CicaLiquid-N CRE, «Канто Кагаку», Токио, Япония).

Для отслеживания вторичных конечных точек исследования участницы вели дневник и заполняли три анкеты на этапах сбора мочи. В дневнике они самостоятельно оценивали ежедневный статус дефекации и делали записи о приёме экспериментального препарата, а также указывали объём кала (весы для взвешивания яиц) и консистенцию (шесть уровней), его запах (пять уровней) и ощущение облегчения во время дефекации (три уровня). Анкета состояла из 21 пункта, 8 из которых включали в себя японскую версию шкалы оценки запора (Constipation Assessment Scale (CAS)).29,30 Остальные вопросы касались состояния кожи, качества сна, ощущения бодрости после пробуждения, настроения, аппетита и состояния тела и оценивались по пятибалльной шкале.


Daigo
Статистический анализ
Для сравнения оценочных пунктов и определения их значимости до и после приёма исследуемого препарата проводился статистический анализ. Нормально и ненормально (ассиметрично) распределённые данные анализировали при помощи t-теста для зависимых выборок и критерия знаковых рангов Вилкоксона соответственно. Для анализа последовательных данных, предполагающих несколько шагов, использовали критерий знаковых рангов Вилкоксона. Для множественных сравнений применялся метод поправки Бонферрони. Оценка отношения между точками данных производилась с использованием коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена и критическим изучением графиков. На рисунках прослеживаются значительные различия: *p < 0,05, **p < 0,01 и *** p < 0,001.

Участницы исследования
Результаты
На Рис. 1 наглядно представлена схема участниц исследования. В испытаниях препарата принимали участие японские женщины в возрасте от 30 до 50 лет с предрасположенностью к запорам. Общее количество человек, подавших заявку, – 642, из них у 60 человек, соответствующих критериям участия, был взят анализ мочи на 3-ИС. По результатам анализа для участия в исследовании было отобрано 30 женщин с наиболее высоким уровнем 3-ИС в моче. По информации, предоставленной самими испытуемыми, они полностью соблюли инструкции по приёму исследуемого препарата (приём 100% препарата); дневники и анкеты заполнены полностью, все анализы мочи взяты. В Таб. 1 представлена основная информация об участницах. Исследование проводилось при участии женщин, средний возраст которых – 44.9 ± 2.8 лет. Частота дефекации по сведениям, предоставленным самими испытуемыми, – около 1 раза в неделю у 9 (30%) участниц, раз в 2-3 дня – у 21 (70%) участницы. Средний уровень 3-ИС в моче до приёма препарата составлял 141.0 ± 60.9 (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение [СО]) мкг/мг Cr), что превышает среднестатистическое значение по стране (45,1 мкг/мг Cr).

По истечении 4 недель уровень 3-ИС в моче снизился на 25% по сравнению с первоначальным значением, что признаётся статистически значимым (p < 0,01). Изменения содержания 3-ИС в моче тесно коррелирует с первоначальными значениями 3-индоксилсульфата (Рис. 2B). Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,74 (p < 0,001).

Кроме того, мы проанализировали изменения уровня 3-ИС в моче путём разделения первоначальных показателей на три группы (Таб. 2): низкий уровень (<100 мкг/мг Cr; n = 8), средний уровень (100-150 мкг/мг Cr; n = 10) и высокий уровень (>150 мкг/мг Cr; n = 12). В группе с высоким уровнем 3-индоксилсульфата в моче этот показатель существенно снизился, при этом снижение, наблюдаемое на четвёртой неделе, было значительнее по сравнению со второй неделей. В группе со средним уровнем отмечалась общая тенденция к снижению. Тем не менее, показатели в группе с низким уровнем практически не изменились.


Примечание: *Представлены усреднённые значения (СО), за исключением случаев, когда указано иное.
Таблица 1. Профиль участниц исследования
Изменение показателей, связанных с дефекацией

Из анкет, заполненных во время исследования, были выделены и проанализированы вопросы, касающиеся шкалы оценки запора CAS. Так, отмечалось, что ко второй неделе приёма LEX значения по CAS уменьшились, и подобная тенденция сохранилась вплоть до 4-ой недели (Рис. 3А). Никто из субъектов исследования не отмечал значительных изменений в кишечной перистальтике, количестве актов дефекации и запахе в процессе опорожнения, что не удивительно, поскольку средняя частота дефекации в неделю на начало исследования составляла 5,87, и такой результат не говорит о склонности к запорам.

Таким образом, в этом анализе изучались данные только тех женщин, которые страдают от частых запоров (дефекация 4 раза в неделю и реже; n = 10). В пределах группы отмечалось существенное учащение дефекации. Аналогичным образом выглядит ситуация с объёмом кала: объём кала, выводимый из организма за один акт дефекации, составлял ≥1,5, в период между первой и четвёртой неделями отмечалось значительное увеличение объёма кала (за один акт дефекации). Наконец, наблюдалось существенное улучшение запаха кала у тех, кто ранее жаловался на неприятный запах (Таб. 3).

Изменения общего физического состояния
В ходе эксперимента, наряду с вопросами о симптомах в абдоминальной области, участниц исследования попросили сообщать о следующих шести показателях: состояние кожи, качество сна, чувство бодрости после пробуждения, настроение, аппетит и тонус тела, характеризуя их по шкале от 1 до 5. В соответствии со статистическими данными, общий результат по шести показателям улучшился ко второй неделе с момента употребления исследуемого препарата, и этот эффект продолжался вплоть до четвёртой недели (Рис. 3B).

Из шести показателей значительные изменения претерпели «состояние кожи», «качество сна», «ощущение бодрости после пробуждения утром», а показатели тонуса также зачастую улучшались (Таб. 4).

Корреляция между содержанием 3-ИС в моче и физическим состоянием
По результатам исследования, выявлена умеренная степень корреляции между уровнями 3-ИС в моче и общим физическим состоянием, в том числе и по показателям CAS (Рис. 4А), для которых коэффициент корреляции Пирсона составил 0,21 (p < 0,05). Наряду с этим, отмечалась корреляция между балльными значениями общего физического состояния и ощущением облегчения во время дефекации (Рис. 4B), а также корреляция между объёмом кала, выводимым из организма за один акт дефекации, и ощущением облегчения (Рис. 4C). Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена составили 0.31 (p<0,01) и 0,51 (p<0,001) соответственно.
Обсуждение результатов
По нашим сведениям, подобных исследований, посвящённых оценке уровня 3-ИС в моче, как показателя изменения кишечной среды на фоне приёма LEX, ранее не проводилось. Данное исследование продемонстрировало, что регулярный приём LEX снижает содержание 3-ИС в моче. Результаты настоящего исследования подтверждают установленный факт: приём LEX положительно сказывается на здоровье человека с повышенным уровнем 3-ИС, свидетельствующим об ухудшении состояния кишечной среды.

Измерение уровня 3-ИС в моче – простой и эффективный метод скрининга дисбактериоза кишечника. По подтверждённым данным, на содержание 3-ИС в моче могут влиять такие распространённые микроорганизмы, как Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,

В будущих научных изысканиях важную роль мог бы сыграть также анализ изменений кишечной микрофлоры. В рамках предыдущих исследований было установлено, что употребление LEX позволило увеличить число разновидностей бифидобактерий и численность бактероидов и снизить популяцию фирмикутов.25

По результатам другого исследования, снизилась концентрация 3-(3-гидроксифенил)-3-гидроксипропионовой кислоты, полученной из фенилаланина (ГФГПК), как маркера присутствия клостридий в моче и концентрация Trp-метаболитов (5-гидроксииндолуксусная, хинолиновая и кинуреновая кислоты) (по неопубликованным данным).31

На основании этих данных можно предположить, что приём LEX приводит к изменениям в кишечной микробиоте и влияет на метаболизм Trp.

Триптофан не только повышает пищевую ценность продуктов, но и играет важную роль в установлении баланса кишечной переносимости микробиоты и её поддержания. В последних исследованиях отмечается, что изменения в микробиоте влияют на иммунную систему организма, контролируя метаболизм Trp. Бактериальные Trp-метаболиты, например, индол и производные индоловой масляной кислоты, могут повлиять на целостность кишечного барьера и клеточные компоненты иммунной системы путём активации прегнан-Х-рецепторов (PXR) или арил-гидрокарбоновых рецепторов (AhR).32-34

Поскольку микробиота кишечника непосредственным образом влияет на типы и уровни Trp-метаболитов, как следствие, она регулирует иммунную реакцию слизистой оболочки и помогает сохранять её целостность путём воздействия на рецепторы типов AhR/PXR соответственно. Кроме того, бактериальные Trp-метаболиты могут регулировать производство интерлейкина-22 (IL-22), который имеет ключевое значение для кишечного гомеостаза благодаря связи с AhR.34

3-индоксил сульфат образуется из индола, катаболизированного триптофаназой; для стимуляции этого процесса большинство бактерий использует Trp, а для замедления – глюкоза. В недавних исследованиях молекулы индола называют «сигнальными» и способными регулировать подвижность бактерий, образование биоплёнки (тонкой плёнки микроорганизмов), устойчивость к антибиотикам и формирование персистирующих клеток.

Кроме того, индол влияет на вирулентность микроорганизма, что сказывается на способности других видов, не производящих индол, например, Salmonella enterica и P. Aeruginosa и даже грибка C. albicans, проникать в клетки организма хозяина.35 Таким образом, изменение содержания 3-ИС в моче в результате приёма LEX свидетельствует об изменениях в метаболизме триптофана и о том, что различные Trp-метаболиты, в том числе и индол, могут воздействовать на желудочно-кишечный тракт как непосредственным образом, так и опосредованно.

3-ИС – типичный уремический токсин, который, как правило, выводится из организма вместе с мочой. Тем не менее, он может накапливаться в крови в случае замедления вывода урины ввиду нарушенной функции почки. По сути, 3-ИС нередко способствует развитию почечных и сосудистых заболеваний. В ряде исследований утверждается, что 3-ИС также негативно влияет на состояние костей, ЦНС и функции сердечно-сосудистой системы.36,37

Так как уровень диализной очистки от 3-ИС гораздо ниже, чем уровень очистки от этого токсина почками, 3-ИС накапливается в плазме крови у пациентов на гемодиализе в относительно высокой концентрации. В редких случаях продолжительный приём LEX пациентами на гемодиализе приводил к снижению содержания 3-ИС в крови и концентрации азота мочевины в крови.38 Аккумуляция 3-ИС в крови зависит от индола, произведённого кишечником, и результаты у этих пациентов соответствуют результатам данного исследования. Таким образом, приём LEX может положительно сказаться на здоровье пациентов с хронической недостаточностью почек.
Вывод:
Подводя итоги проведённому исследованию, отметим, что пероральный приём LEX в течение 4 недель позволил снизить уровень 3-индоксил сульфата в моче женщин с высоким содержанием 3-ИС и уменьшить частотность образования запоров у женщин, страдающих от этой проблемы. Кроме того, была установлена корреляция между самооценкой общего физического состояния и уровня 3-ИС в моче. Исследование подтвердило наличие эффекта LEX, принимаемого перорально, на кишечную среду и эффективность мониторинга концентрации 3-ИС в моче как метода, помогающего отслеживать изменения в кишечной среде и физическом состоянии.

Благодарность
Выражаем свою благодарность всем участникам и подавшим заявки, принявшим участие в данном исследовании. Мы благодарим «Хэлскер Системз Ко., Лтд.» за оказанную техническую поддержку при проведении анализов мочи. Кроме того, особая благодарность выражается Мидзукоси Р. и Сато Т. («Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд.») за их содействие в организации испытания. Помимо этого, мы хотели бы поблагодарить Энаго за редакцию англоязычной версии статьи.
Финансирование
Настоящее исследование финансировалось компанией «Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд.».

Публикация
МФ, РМ и ЯС получают компенсацию от «Б энд С Корпорейшн Ко., Лтд.». ТЯ и ММ получают компенсацию от «Хэлскер Системз Ко., Лтд.». У КФ нет конфликта интересов, который был бы непосредственно связан с содержанием настоящей статьи. По сведениям авторов, в данной работе отсутствуют какие-либо иные конфликты интересов.

Список литературы
1. Durack J, Lynch SV. The gut microbiome: relationships with disease and opportunities for therapy. J Exp Med. 2019;216(1):20-40. doi:10.1084/jem.20180448

2. Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 2010;464 (7285):59-65. doi:10.1038/nature08821

3. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature. 2012;489(7415):220-230. doi:10.1038/nature11550

4. Ferguson JF, Allayee H, Gerszten RE, et al. Nutrigenomics, the microbiome, and gene-environment interactions: new directions in cardiovascular disease research, prevention, and treatment: a scientific statement from the American heart association. Circ Cardiovasc Genet. 2016;9(3):291-313. doi:10.1161/HCG.0000000000000030

5. Wang Z, Klipfell E, Bennett BJ, et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature. 2011;472(7341):57-63. doi:10.1038/nature09922

6. Hsiao EY, McBride SW, Hsien S, et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 2013;155(7):1451-1463. doi:10.1016/j.cell.2013.11.024

7. Tang WH, Wang Z, Levison BS, et al. Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk. N Engl J Med. 2013;368(17):1575-1584. doi:10.1056/NEJMoa1109400

8. Zhang LS, Davies SS. Microbial metabolism of dietary components to bioactive metabolites: opportunities for new therapeutic interventions. Genome Med. 2016;8(1):46. doi:10.1186/s13073-016-0296-x

9. Kirkland JL, Vargas E, Lye M. Indican excretion in the elderly. Postgrad Med J. 1983;59(697):717-719. doi:10.1136/pgmj.59.697.717

10. Bures J, Cyrany J, Kohoutova D, et al. Small intestinal bacterial overgrowth syndrome. World J Gastroenterol. 2010;16 (24):2978-2990. doi:10.3748/wjg.v16.i24.2978

11. de Andrade LS, Ramos CI, Cuppari L. The cross-talk between the kidney and the gut: implications for chronic kidney disease. Nutrire. 2017;42(1):27. doi:10.1186/s41110-017-0054-x:

12. Greenberger NJ, Saegh S, Ruppert RD. Urine indicant excretion in malabsorptive disorders. Gastroenterology. 1968;55(2):204-211. doi:10.1016/S0016-5085(19)34071-5