Изменения в фосфолипидном составе мембран эритроцитов при болезни Альцгеймера

Существует ряд исследований, указывающих на снижение содержания этаноламин-плазмалогена (pl-PE) в тканях мозга и сыворотке у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (БА).

Настоящее исследование направлено на изучение состава фосфолипидов эритроцитов, в том числе pl-PE, у пациентов, страдающих БА. Метод: Был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющий разделять интактные плазмалогены и все другие классы фосфолипидов за один хроматографический прогон.

Результаты:
Было установлено низкое по отношению к сфингомиелину содержание pl-PE, фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилсерина (PS) по сравнению с показателями контрольной группы соответствующего возраста.
Вывод:
Эти изменения в фосфолипидах эритроцитов могут быть следствием окислительного стресса, что указывает на высокую степень окислительного стресса в периферической крови пациентов, страдающих БА.

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной причиной слабоумия у пожилых людей. По мере увеличения средней продолжительности жизни БА становится серьезной проблемой для мировой медицины.

Несколько исследований указывают на уменьшение содержания этаноламин-плазмалогена (pl-PE) в тканях мозга пациентов, страдающих БА [1-3]. Также было установлено, что сыворотка пациентов, страдающих БА, имеет пониженное содержание pl-PE и что и что снижение содержания pl-PE в сыворотке коррелирует с тяжестью деменции [4, 5].

У животных плазмалогены присутствуют преимущественно в клеточной мембране тканей, следовательно, периферические кровяные клетки содержат намного больше pl-PE, чем сыворотка. Мы ранее сообщали о возможности разделять интактные плазмалогены и другие фосфолипиды за один прогон при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6]. Метод ВЭЖХ обнаруживает лишь следы pl-PE человеческой сыворотки, однако четко определяет pl-PE человеческих эритроцитов [6].

Сообщается об аномалиях эритроцитов у пациентов, страдающих БА [7-11], аномалии же pl-PE эритроцитов пока не исследовались.

В настоящем исследовании мы измерили фосфолипидный состав, в том числе pl-PE, эритроцитов у пациентов, страдающих БА, и сравнили его с данными контрольных субъектов соответствующей возрастной группы.

Пациенты

В исследовании, проведенном Отделением неврологии Университетской клиники Фукуока, Япония, приняли участие шестнадцать пациентов, страдающих БА, и контрольная группа из 15 здоровых субъектов соответствующего возраста.

Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено Экспертным советом Университетской клиники Фукуока. БА была диагностирована клинически, в том числе по Краткой шкале оценки психического статуса (MMSE).

Пациенты с высоким отношением (>2) липопротеинов низкой плотности к липопротеинам высокой плотности, ожирением, гипертонией и высоким уровнем сахара в крови были исключены из контрольной группы, а пациенты с высоким показателем С-реактивного белка (>1 мг/100 мл) были исключены из обеих групп. Возраст, пол и показатель MMSE приведены в таблице 1.

Показатели общего холестерина в сыворотке, липопротеинов низкой плотности, липопротеинов высокой плотности, триглицеридов, уровня сахара в крови и С-реактивного белка у пациентов с БА статистически не отличались от показателей контрольной группы.

Получение эритроцитов

Венозную кровь пациентов, отобранную натощак, была помещена в пробирки, содержащие ЭДТА-2Na. Кровь была охлаждена на ледяной бане, выдержана в холодильнике и обработана в течение 48 ч. Плазма и лейкоцитарная пленка были удалены после центрифугирования при 1000 g в течение 5 мин при 4°С, эритроциты были трижды промыты в холодном изотоническом солевом растворе при 1000 g в течение 5 мин при 4°С. При каждой промывке удаляли небольшую часть верхнего слоя.

Определение липидного состава эритроцитов

Экстракция липидов из эритроцитов была произведена в соответствии с методом, описанным в работах Mawatari et al. [6] и Dise et al. [12]. 500 мкл уплотненных эритроцитов были гемолизированы в равном объеме фосфатного буферного раствора 10 ммоль (рН 7,4). В лизат ввели четыре миллилитра метанола, а затем через 40 минут 4 мл хлороформа. Еще через 30 мин экстракт был центрифугирован, а остаток повторно экстрагирован 4 мл смеси метанола и хлороформа (1:1, об/об). Метанол и хлороформ, использованные при экстракции липидов, содержали бутилгидрокситолуол (50 мг/л). Объединенные экстракты были промыты 10 мл KCl 10 ммоль для получения двухфазной смеси. Один миллилитр нижней фазе липидного экстракта был высушен газом N2.

Разделение фосфолипидных классов, включая плазмалогены, посредством ВЭЖХ было проведено по описанному нами методу [6,13]. Была использована система ВЭЖХ Agilent HPLC (Agilent Technologies, Токио, Япония) с испарительным нефелометрическим детектором. Система была подключена к рабочей станции Chem Station (Agilent Technology), которая использовалась для контроля и анализа хроматограмм. Высушенные общие липиды были растворены в 200 мкл смеси гексана и 2-пропанола (1:1, об/об), и после фильтрации через фильтр 0,2 мкм 20 мкл раствора было помещено в систему ВЭЖХ.

Рис. 1. Репрезентативная ВЭЖХ-хроматограмма липидов эритроцитов человека. Липиды обнаружены испарительным нефелометрическим детектором. Данный метод ВЭЖХ выявил несколько пиков сфингомиелина; два наибольших пика обозначены SM-1 и SM-2. Chol = холестерин.

Статистический анализ

Мы проанализировали данные с использованием парного (двустороннего) t-критерия с уровнем значимости р <0,05.

Классы фосфолипидов в мембранах эритроцитов, включая pl-PE и холестерин, были определены одновременно за один прогон ВЭЖХ (рис. 1).

Относительный состав фосфолипидных классов был рассчитан по хроматографической области каждого из них, после чего были определены отношения глицерофосфолипидов к сфингомиелину (СМ) (таблица 2). Отношение pl-PE к СМ у пациентов с БА было ниже, чем в контрольной группе (таблица 2).

Отношение фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилсерина (PS) к СМ также было пониженным. Отношение фосфатидилхолина (PC) к СМ было одинаковым.

Циркулирующие эритроциты человека не содержат внутриклеточный органелл, следовательно, липиды присутствуют только в клеточной мембране. Поэтому липиды, экстрагированные из промытых эритроцитов, являются липидами мембран эритроцитов.

СМ в мембране эритроцитов человека содержит небольшое число полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК); в то же время, PS содержит большое количество докозагексаеновой и арахидоновой кислоты [13, 14]. В мембране эритроцитов человека PS содержит больше ПНЖК, чем PE, а PC содержит намного меньше ПНЖК, чем PS и PE [13,14]. Известно, что фосфолипиды с высоким содержанием ПНЖК подвержены окислительному стрессу [15,16]. Наши прошлые исследования показали, что относительное содержание СМ и PC увеличивалось, в отличие от PS, PE и pl-PE, когда эритроциты человека инкубировали в трет-бутилгидропероксиде (tBHP) [6].

Таким образом, отношение каждого глицерофосфолипида к СМ является достоверным показателем степени перекисного изменения каждого глицерофосфолипида [6,14].

В нашем предыдущем исследовании [13] pl-PE в эритроцитах человека имел более высокое содержание ПНЖК, чем PS и PE, и снижение содержания pl-PE в эритроцитах человека вследствие окисления tBHP примерно в два раза превышало снижение содержания PE и PS [6]. В настоящем исследовании степень снижения pl-PE была наибольшей среди глицерофосфолипидов, а степень снижения PS была больше, чем степень снижения PE (таблица 2). Снижения PC не отмечено.

Эти результаты очень близки к результатам окисления эритроцитов человека tBHP [6]. Следовательно, представляется, что изменения в эритроцитах фосфолипидов при БА соответствуют изменениям от окислительного стресса.

Во многих исследованиях возможных периферийных биомаркеров БА указывается на присутствие высокого окислительного стресса в сыворотке и эритроцитах пациентов с БА [10, 17-21], однако происхождение окислительного стресса в сыворотке и эритроцитах не установлено окончательно. Сообщается о присутствии аномального амилоидного β-пептида в крови пациентов с БА [22-24], а также о взаимодействии при БА амилоидного β-пептида с эритроцитами [25-28].

В работе Jayakumar et al. [25] сообщается, что инкубация амилоидного β-пептида в эритроцитах человека привела к связыванию амилоидного β-пептида с эритроцитами и окислению эритроцитов. В недавнем исследовании Nakagawa et al. [28] установлено, что как инкубация эритроцитов человека в амилоидном β-пептиде, так и инъекции амилоидного β-пептида мышам приводят к связыванию амилоидного β-пептида и эритроцитов и что оба эксперимента вызвали переокисление фосфолипидов эритроцитов. Следовательно, амилоидный β-пептид может быть источником окислительного стресса в крови пациентов с БА.

Результаты настоящего исследования указывают на анормальный фосфолипидный состав мембран эритроцитов в группе пациентов с БА, что является признаком высокого окислительного стресса в циркулирующей крови по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста, не страдающей деменцией.

Благодарности

Мы выражаем благодарность Сейбину Чену и Юко Терасаки за оказанную техническую помощь.

Данный текст охраняется законом РФ о защите авторских прав, а также международным законодательством в этой области.

Любое частичное или полное копирование и воспроизведение без разрешения владельца запрещено. Лица, виновные в нарушении авторских прав и исключительных прав на использование текста, несут гражданско-правовую, административную и уголовную ответственность"