НИИ Скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

От пробиотиков к метабиотикам: эволюция развития

НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ, Москва, Россия
Дата поступления статьи: 17.08.2016

Попова Тамара Сергеевна

Заведующая научной лабораторией, доктор биологических наук, профессор, лауреат государственной премии СССР, лауреат премии Москвы в области медицины

Тропская Наталия Сергеевна

Ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук, лауреат премии Москвы в области медицины

Черненькая Татьяна Витальевна

Заведующая научной лабораторией клинической микробиологии, к.м.н.

Кислякова Екатерина Александровна

Младший научный сотрудник

От пробиотиков к метабиотикам: эволюция развития

Нельзя повернуть время вспять, но можно отследить исторический путь!

Пробиотики, 1960 г.

Вначале появились пробиотики. Врачи стали использовать живые, полезные для человека микроорганизмы, выращенные в лабораториях, чтобы решить проблемы с дисбактерозами. Идея была «подселить» в организм чужие полезные кишечные бактерии после того, как свои были уничтожены антибиотиками. Казалось, что новые «жители» подстроятся, со временем приживутся и так восстановится баланс микрофлоры.

Но спустя 20 лет, врачи и ученые убедились, что пробиотики не приживаются в организме! Наша иммунная система, работающая по принципу «свой-чужой», отвергает чужеродные микроорганизмы и выводит их в течение 5-7 дней.

Пребиотики, 1980 г.

Если чужое не приживается, нужно усилить свое! Так появились пребиотики – «корм» для наших бактерий. Ведь если как следует накормить полезные бактерии, они станут сильнее и вытеснят вредные. Но выяснилось, что вместе с полезными бактериями пребиотики кормят и плохие! Проблема не решалась.

Синбиотики, 1990 г.

Как сделать так, чтобы пробиотики оставались в организме как можно дольше? Возникла идея «кормить гостей» – соединить про-и пребиотики!
Казалось, что решение поставит точку в вопросе восстановления баланса микрофлоры кишечника, но..иммунная система все равно распознавала «чужаков» и беспощадно расправлялась с ними! Микрофлора у каждого уникальна и неповторима как видами бактерий, так их количеством

Ученые продолжили исследования, которые привели к тому, что на свет появилось принципиально новое средство.

В экспериментах на крысах изучена эффективность экстракта брожения кисломолочных бактерий Daigo с целью профилактики и коррекции нарушений состава микрофлоры и изменений моторной активности тонкой кишки при дисбиозе.

Экспериментальный дисбиоз, вызванный 7-дневным пероральным приемом противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол), проявлялся существенными нарушениями в качественном и количественном составе микрофлоры тощей и слепой кишки. Профилактическое введение Daigo до введения противомикробных препаратов устраняло признаки дисбиоза.

Введение Daigo после моделирования дисбиоза приводило к восстановлению моторной функции кишечника, нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке и снижению содержания условно-патогенных микроорганизмов в слепой кишке.

Ключевые слова: экстракт брожения кисломолочных бактерий, микрофлора, моторная функция кишечника, экспериментальный дисбиоз.

Введение

Как известно, дисбактериоз кишечника – это синдром, сопутствующий многим патологическим состояниям и являющийся, в сущности, следствием патологического процесса.

Среди многих причин возникновения дисбактериоза значимое место занимают нарушения микробиоценоза вследствие приема антибактериальных препаратов. Современные антибиотики являются основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы. Часто вследствие их бесконтрольного использования отмечается гибель не только патогенных микроорганизмов в естественных биотопах, но и представителей нормальной микрофлоры человека.

Концепция функционального питания, впервые сформулированная в Японии в конце 1990-х годов, получила широкое признание в решении проблемы коррекции состояния микроэкологической системы человека, являясь в наиболее развитых странах мира одним из приоритетных направлений в профилактике и лечении большинства хронических заболеваний.

Функциональное питание объединяет продукты естественного или искусственного происхождения, которые предназначены для систематического ежедневного употребления и оказывают регулирующее действие на физиологические функции, биохимические реакции и психосоциальное поведение человека через нормализацию его микроэкологического статуса.

В последнее время очень часто вопросы функционального питания обсуждаются в контексте развития проблемы использования про-, пре- и синбиотиков . Это связано прежде всего с тем, что концепция функционального питания становится более направленной на специальные продукты, которые могут положительно влиять на состав кишечной микрофлоры. Так, при первом успешном опыте трансплантации тонкой кишки в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского было продемонстрировано, что коррекция микрофлоры органов желудочно-кишечного тракта с помощью 2% раствора свекловичного пектина и пробиотиков привело к элиминации условно-патогенной флоры.

С апреля 2015 г. на российском рынке функциональных продуктов зарегистрирован и разрешен к применению японский продукт Daigo для поддержания микробиоценоза кишечника, усиления иммунитета, а также решения гастроэнтерологических проблем. В качестве активного ингредиента Дайго содержит специально подобранный экстракт брожения 16 штаммов лактобактерий.

Daigo был разработан в качестве нового типа продуктов, производимых из кисломолочных бактерий, способствующих улучшению функционального состояния желудочно-кишечного тракта. В отличие от пробиотиков Daigo не содержит живых кисломолочных бактерий. Daigo представляет собой смесь пептидов – биорегуляторов, экстрагированных из бактериальных клеток 16 штаммов физиологических лактобактерий, колонизирующих кишечник здорового человека. Для получения соевого молока, используемого в качестве среды для культивирования кисломолочных бактерий, применяются специальные соевые бобы, выращенные органическим путем без пестицидов и химикатов.

Экстракт кисломолочных бактерий является смесью секреторных продуктов и клеточных веществ кисломолочных бактерий, полученных при их брожении. Исследования последних лет показали, что клеточные вещества и продукты брожения метаболизированных кисломолочных бактерий оказывают лучшее действие на кишечную регуляцию и жизненные функции, чем жизнеспособные кис-ломолочные бактерии.

Цель исследования – изучение эффективности функционального продукта Дайго в профилактике и коррекции состава микрофлоры и моторных нарушений тонкой кишки при экспериментальном дисбиозе у крыс.

Дизайн исследования

Исследования были проведены на 28 взрослых крысах самцах (масса тела – около 300 г, возраст – 4 месяца) линии Вистар.

Крысы были получены из питомника ООО «НеоМаркет». Все экспериментальные животные содержа-лись в стандартных условиях вивария НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, получали воду и сбалансированный рацион питания (гранули-рованный корм, изготовленный по заказу ООО «Лабораторкорм») без ограничения. Световой режим – естественный.

Все животные были разделены на 4 экспериментальные группы по 7 животных в каждой:

1. Контрольная группа – интактные животные (n = 7). У этих крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микро-биологического исследования.
2. Группа «Дисбиоз» – группа с эксперимен-тальным дисбиозом (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 7 суток перорально вводили раствор противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол). На 8-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.
3. Группа «Дисбиоз + Daigo» – группа с экспериментальным дисбиозом и корригирующим введением тестируемого раствора Daigo (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 7 суток перорально вводили раствор противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол), а с 8- го по 21-й день – тестируемый раствор Daigo. На 22-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.
4. Группа «Daigo + Дисбиоз» – группа с профилактическим введением тестируемого раствора Дайго и последующим введением противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) (n = 7). Крысам ежедневно однократно в течение 14 суток перорально вводили тестируемый раствор Daigo, затем с 15-го по 21-й день – раствор противомикробных препаратов. На 22-е сутки эксперимента у крыс была измерена эвакуаторная активность кишечника, а также взяты образцы содержимого тощей и слепой кишки для микробиологического исследования.

Дозы, схема и способ введения препаратов

Раствор Daigo вводили в количестве 0,33 мл/кг, амоксициклин – в дозе 28,5 мг/кг, метронидазол – в дозе 22,8 мг/кг.
Перед введением каждое животное взвешивали и производили расчет дозы препарата с учетом индивидуальной массы тела крысы.

Противомикробные препараты и исследуемый продукт Daigo вводили перорально, ежедневно с 9 до 11 часов утра.

Измерение эвакуаторной активности тонкой кишки
Измерение эвакуаторной активности тонкой кишки у экспериментальных
животных производили с помощью инертного маркера Evans Blue.

Для измерения эвакуаторной активности кишечника крысам per os вводили маркер Evans Blue. Через 20 минут крыс усыпляли. На вскрытии выделяли тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) и измеряли длину всей кишки и расстояние, которое прошел маркер за 20 минут. Индекс транзита – ИТ, выраженный в процентах, определяли как отношение расстояния, пройденного маркером, к общей длине кишки, умноженное на 100.

Сбор проб для бактериологического исследования

Для забора проб выделяли участок тощей кишки на расстоянии 15 см от связки Трейтца длиной 5 см. В стерильную пробирку специальной лопаточкой брали кишечное содержимое (для исследования полостной микрофлоры тощей кишки). Затем выделенный участок промывали стерильным физиологическим раствором, производили соскоб пристеночного слоя (для исследования пристеночной микрофлоры тощей кишки) и помещали пробу в стерильную пробирку. Далее выделяли слепую кишку. В стерильную пробирку специальной лопаточкой брали кишечное содержимое (для исследования полостной микрофлоры слепой кишки).

Бактериологические исследования Микробиологическое исследование кала и содержимого тощей и слепой кишки проводили в соответствии с нормативными документами, принятыми для исследования кала у людей: отраслевым стандартом 91500.11.0004-2003 "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника". Были изучены 9 групп микроорганизмов: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli (E.coli), Proteus mirabilis, Klebsiella spp., неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ), Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp.
Данные представляли в виде медианы и персентилей – Ме (25; 75)%. Для статистического анализа использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считались значения при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Изучение эффективности функционального продукта Дайго в профилактике и коррекции моторных нарушений тонкой кишки при экспериментальном дисбиозе у крыс

Через 7 дней приема противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) у животных в группе «Дисбиоз» было выявлено статистически значимое замедление транзита содержимого по кишечнику по сравнению с контрольной группой – с 30,34 (19,56; 44,55)% до 25,17 (23,41; 31,84)% (p < 0,05).

При изучении изменений моторной функции тонкой кишки у животных группы «Дисбиоз+Daigo» отмечена тенденция к восстановлению транзита по кишечнику до 32,17 (24,05; 37,76)% по сравнению с группой «Дисбиоз» – 25,17 (23,41; 31,84)% (p > 0,05).

При сравнении изменений эвакуаторной функции тонкой кишки у животных группы «Дисбиоз+Daigo» с контрольной группой статистически значимых различий не выявлено. Так, в группе «Дисбиоз+Daigo» ИТ составлял 32,17 (24,05; 37,76)%, а в контрольной – 30,34 (19,56; 44,55)% (p > 0,05), что свидетельствовало о нормализации транзита кишечного содержимого после приема Daigo.

При сравнении изменений моторной функции тонкой кишки у животных группы «Daigo + Дисбиоз» по отношению к группе «Дисбиоз» выявлена тенденция к восстановлению транзита содержимого по кишечнику. Так, в группе «Daigo + Дисбиоз» ИТ составлял 30,16 (28,36; 36,15)%, а в группе «Дисбиоз» – 25,17 (23,41; 31,84)% (p > 0,05). При сравнении изменений эвакуаторной функции тонкой кишки у животных группы «Daigo + Дисбиоз» с контрольной группой статистически значимых различий не выявлено.

Так, в группе «Daigo + Дисбиоз» ИТ составлял 30,16 (28,36; 36,15)%, а в контроль-ной – 30,34 (19,56; 44,55)% (p > 0,05), что свидетельствовало о нормализации транзита кишечного содержимого при приеме Daigo.

Таким образом, при моделировании экспериментального дисбиоза происходит нарушение моторной функции тонкой кишки, выражающееся в замедлении скорости транзита содержимого по кишечнику. Введение Daigo с целью как коррекции, так и профилактики дисбиоза приводит к нормализации моторной функции тонкой кишки.

Изучение эффективности функционального продукта Дайго в профилактике и коррекции состава микрофлоры при экспериментальном дисбиозе у крыс

Результаты изучения влияния 7-дневного приема противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) на состав микрофлоры тощей и слепой кишки представлены в табл. 1.

Данные таблицы показывают, что при экспериментальном дисбиозе развиваются существенные нарушения в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Так, в полости тощей кишки у некоторых животных обнаружили появление Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. При этом в пристеночном слое тощей кишки высеивались Enterococcus spр., Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке выявили наличие Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae.

Отметим, что в контрольной группе эти микроорганизмы не были обнаружены ни у одного животного.
В полости тощей кишки статистически значимо увеличивалось количество Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр., в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо повышалась численность Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Lactobacillus spр. В слепой кишке изменения в количественном отношении микроорганизмов по отношению к контролю были статистически значимы для всех изученных видов за исключением Kl.pneumoniae. Так, выявлено увеличение в 100 раз численности Enterococcus spр. и E.coli, а количество Staphylococcus spр., Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. было снижено.

Таким образом, по нашим данным, 7-дневный прием противомикробных препаратов (амоксициклин+метронидазол) приводит к существенным нарушениям в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Такие изменения, проявляющиеся в повышении количества E.coli в тонкой и слепой кишке, в перераспределении лакто- и бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника (уменьшение их количества в слепой и увеличение в тонкой), а также в появлении условно-патогенных видов микроорганизмов, не характерных для здоровых животных в тонкой и слепой кишке, могут свидетельствовать о возникновении дисбактериоза 3-й степени (по классификации В.М. Бондаренко).

При изучении изменений микрофлоры тощей и слепой кишки при корригирующем введении Дайго после моделирования экспериментально-го дисбиоза (группа «Дисбиоз + Daigo») получены следующие результаты (табл. 2).
Как видно из таблицы, у животных, которым вводили Дайго на фоне экспериментального дисбиоза, наблюдаются существенные изменения в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке по сравнению с животными с дисбиозом. Так, в полости тощей кишки у всех животных исчезли Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae, в пристеночном слое тощей кишки исчезли Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке исчезли Proteus mirabilis и Kl.pneumoniae.

В полости тощей кишки статистически значимо уменьшилось количество Enterococcus spр., E.coli, Proteus mirabilis, а в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо понизилась численность Bifidobacterium spр. В слепой кишке статистически значимо увеличилось количество Staphylococcus spр.

Таким образом, наиболее значимым эффектом корригирующего влияния Daigo на фоне экспериментального дисбиоза по сравнению с животными с дисбиозом являются исчезновение условно-патогенной микрофлоры в пристеночном слое тонкой кишки и значительное снижение ее содержания в полости тонкой кишки.

Приводит ли корригирующее введение Дайго на фоне экспериментального дисбиоза к нормализации микрофлоры?

С этой целью было выполнено сравнение данных бактериологических исследований группы животных «Дисбиоз + Daigo» с контрольной группой (табл. 3).
Как видно из таблицы, у животных, которым вводили Daigo на фоне экспериментального дисбиоза, отсутствуют статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой в количественном составе условно-патогенной полостной и пристеночной микрофлоры тощей кишки, что свидетельствует о нормализации численности этих видов микроорганизмов при введении Дайго на фоне экспериментального дисбиоза. Кроме того, на фоне введения Дайго в полости тощей кишки было отмечено увеличение численности Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. (в 100 раз) по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных, а в пристеночном слое тощей кишки в 10 раз повысилось количество Lactobacillus spр. В слепой кишке по сравнению с контрольной группой статистически значимо уменьшилась численность Staphylococcus spр. (в 10 раз), Lactobacillus spр. (в 10 раз) и Bifidobacterium spр. (в 100 раз).

Таким образом, корригирующее введение Daigo после моделирования экспериментального дисбиоза приводит к нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке. В слепой кишке происходит снижение содержания как условно-патогенных микроорганизмов, так и лакто- и бифидобактерий по сравнению со здоровыми животными, что может свидетельствовать об эффективной коррекции экспериментального дисбиоза.

Интересно отметить, что корригирующий прием Daigo на фоне экспериментального дисбиоза приводит к увеличению количества Lactobacillus spр. как в полости, так и в пристеночном слое тонкой кишки. Кроме того, происходит перераспределение бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника – наблюдается увеличение их количества в полости тонкой кишки и снижение в слепой.
При изучении изменений микрофлоры тощей и слепой кишки на фоне профилактического введения Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза (группа «Daigo + Дисбиоз») получены следующие результаты (табл. 4).

Данные таблицы свидетельствуют о том, что у животных с профилактическим введением Daigo при моделировании экспериментального дисбиоза наблюдались существенные изменения в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке по сравнению с животными с дисбиозом. Так, в полости тощей кишки у всех животных исчезли Kl.pneumoniae, в пристеночном слое тощей кишки исчезли Proteus mirabilis, Enterobacter spр. и Kl.pneumoniae. В слепой кишке исчезли Kl.pneumoniae.
Кроме того, в полости тощей кишки статистически значимо уменьшилось количество Proteus mirabilis (в 1000 раз), в пристеночном слое тощей кишки статистически значимо понизилась чис-ленность E.coli (в 10 000 раз). В слепой кишке статистически значимо увеличилось количество E.coli (в 10 раз).









Таким образом, наиболее значимым эффектом профилактического влияния Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза по сравнению с животными с дисбиозом является исчезновение и (или) значительное снижение условно-патогенной микрофлоры в полости и пристеночном слое тонкой кишки.

Приводит ли профилактическое введение Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза к нормализации микрофлоры?

С этой целью было выполнено сравнение данных бактериологических исследований группы животных «Daigo + Дисбиоз» с контрольной группой (табл. 5). Согласно данным, приведенным в таблице, у животных с профилактическим введением Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза отсутствуют статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой в количественном составе условно-патогенной пристеночной микрофлоры тощей кишки, что свидетельствует о нормализации численности этих видов микроорганизмов при профилактическом приеме Дайго.

Кроме того, в пристеночном слое тощей кишки произошло увеличение численности Lactobacillus spр. (в 10 раз) по сравнению с ее значениями у интактных животных. Количественный состав условно-патогенной полостной микрофлоры тощей кишки также статистически значимо не отличался от такового в контрольной группе, за исключением E.coli, количество которой возросло в 100 раз по сравнению с контролем. Кроме того, в полости тощей кишки произошло увеличение содержания Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр. (в 100 раз) по сравнению с интактными животными.





В слепой кишке наблюдались появление Proteus mirabilis и Enterobacter spр., рост числа Enterococcus spр. и E.coli, снижение количества Lactobacillus spр. и Bifidobacterium spр.

Таким образом, профилактическое введение Дайго при моделировании экспериментального дисбиоза приводит к исчезновению условно-патогенных микроорганизмов в пристеночном слое тощей кишки и нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в полости тощей кишки (за исключением E.coli). Как и в серии с корригирующим приемом Дайго, его профилактическое введение при моделировании экспериментального дисбиоза приводит к увеличению количества Lactobacillus spр. в тонкой кишке как в полости, так и в пристеночном слое.

Кроме того, происходит перераспределение содержания бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника – наблюдаются увеличение их количества в полости тонкой кишки и снижение в слепой.

Заключение

В данном исследовании экспериментальный дисбиоз, ассоциированный с использованием противомикробных препаратов, у крыс был вызван пероральным введением двух противомикробных препаратов широкого спектра действия – амоксициклина и метронидазола – на протяжении 7 суток.

Было показано, что 7-дневный прием противомикробных препаратов приводит к существенным нарушениям в качественном и количественном составе микрофлоры как в тощей, так и в слепой кишке. Такие изменения, проявляющиеся в повышении количества E.coli в тонкой и слепой кишке, в перераспределении лакто- и бифидобактерий между верхними и нижними отделами кишечника (уменьшение их количества в слепой и увеличение в тонкой), а также в появлении условно-патогенных видов микроорганизмов, не характерных для здоровых животных в тонкой и слепой кишке, могут свидетельство-вать о возникновении тяжелого дисбактериоза 3-й степени (по классификации В.М. Бондаренко).

Глубокие дисбиотические изменения в кишечнике у крыс сопровождались нарушением моторной функции кишечника, выражающиеся в замедлении транзита кишечного содержимого.

Корригирующее введение Дайго после развития экспериментального дисбиоза приводило к нормализации численности условно-патогенных микроорганизмов в тощей кишке. В слепой кишке происходило снижение содержания условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с таковым у здоровых животных, что может свидетельствовать об эффективной коррекции экспериментального дисбиоза.

Эти изменения микрофлоры сопровождались восстановлением моторной функции кишечника.
Профилактическое введение Дайго до моделирования экспериментального дисбиоза приводило к исчезновению условно-патогенных микроорганизмов в пристеночном слое тощей кишки и нормализации их численности в полости тощей кишки (за исключением E.coli). Эти изменения микрофлоры сопровождались нормализацией моторной функции кишечника.

Таким образом, проведенные исследования на крысах показали значительную эффективность экстракта брожения кисломолочных бактерий Дайго как для профилактики, так и коррекции нарушений моторной активности тонкой кишки и микробиоценоза кишечника при экспериментальном дисбиозе.